CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA PARA AMINOÁCIDOS
1.- FUNDAMENTO TEÓRICO
La cromatografía es un método físico para separar e identificar compuestos. Se basa en que cualquier sustancia, al ser disuelta en dos disolventes distintos no miscibles, se reparte entre ambos con arreglo a su solubilidad. La relación entre las solubilidades de dicha sustancia en cada uno de los disolventes se denominaCoeficiente de Reparto.
Si uno de los disolventes se mantiene fijo (Fase Estacionaria) se puede hacer desplazar el otro disolvente (Fase Móvil) sobre el primero. Las sustancias a cromatografiar se verán sometidas a una distribución entre las fases estacionaria y móvil de modo que las más solubles en la fase móvil avanzarán más que las que sean retenidas por la fase estacionaria.
Deacuerdo con el mecanismo que produce la separación, se puede hablar de distintos tipos de cromatografía:
– Cromatografía de reparto
La fase estacionaria suele ser agua, mantenida fija mediante un soporte inerte poroso (papel o celulosa). La fase móvil suele ser una mezcla de disolventes medianamente miscibles con el agua. Cuanto más soluble en agua la sustancia a cromatografiar, másretenida y retrasada quedará en el desarrollo cromatográfico.
– Cromatografía de adsorción
La fase estacionaria retiene con más o menos poder a las sustancias a cromatografiar por un fenómeno de adsorción en superficie. Para ello se utiliza alúmina, gel de sílice, etc.
La Cromatografia de afinidad es un tipo de cromatografía de adsorción en la que la fase estacionaria tieneafinidad biológica por la sustancia que se quiere separar, por lo que no intervienen propiedades físicas o químicas. Se utilizan así parejas antígeno-anticuerpo, enzima-inhibidor etc.
En la Cromatografía de intercambio iónico, la fase estacionaria retiene a las sustancias por su carga iónica, ya que posee multitud de restos iónicos de un solo tipo H+ en resinas ácidas y OH- en resinas básicas. Lassustancias con carga opuesta quedarán retenidas en la fase estacionaria, mientras que las de la misma carga que la resina serán arrastradas por la fase móvil. Las sustancias que quedan unidas a la resina pueden eluirse cambiando las condiciones de la fase móvil (variando el pH, fuerza iónica etc). Este tipo de cromatografía se hace sólo en columna y los soportes utilizados son polímeros talescomo celulosa o poliestireno carboxilados o poliaminados etc.
De acuerdo con el soporte físico sobre el que se realiza la separación, se puede hablar de dos tipos de cromatografía:
1.- Cromatografía en capa fina: cuando la fase estacionaria se extiende sobre una placa.
2.- Cromatografía en columna: cuando la fase estacionaria se empaqueta en una columna
En ambos casos,la fase móvil es un líquido. Si la fase estacionaria está en una columna y se utiliza gas como fase móvil, se denomina Cromatografía de gases.
BIBLIOGRAFIA
.- PLUMMER, D.T. Introducción a la Bioquímica Prácticas. Ed. Mc Graw Hill. Latinoamerica (1981).
.- CRANDALL, G.D. Biochemistry Laboratory, Selected Exercices. Ed.Oxford Universit Press (1983).
2.- MATERIAL Y REACTIVOS
Material
-Cromatoplaca
– Cubeta de cromatografía (frasco de vidrio)
– Capilares
– Estufa
Reactivos
– Soluciones de aminoácidos patrón (serina, fenilalanina y arginina)
– Solución problema de aminoácidos
– Ninhidrina al 0,2% en etanol 96%
– Cloroformo, metanol, amoniaco
3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
El objetivo de esta práctica es la separación de una mezcla de aminoácidos. Para ellose dispone de soluciones de aminoácidos conocidos (patrones) y una solución problema de aminoácidos para identificar.
Se procederá de la forma siguiente: en la cromatoplaca que cada alumno recibe se aplican, mediante capilares, las soluciones de aminoácidos patrón y la solución problema. La aplicación de patrones y problema se realizará aproximadamente a una distancia de 1 cm del extremo…
